離體全腦製備(ex vivo brain explant)
把果蠅的整顆腦取出,泡在持續供氧或灌流的養液裡,在顯微鏡下一邊刺激、一邊記錄神經元。 好處是能用藥物或外加通道精準控制「氣味訊號」與「多巴胺」各在何時出現;代價是沒有真實的氣味與行為,腦的自發活動也和活果蠅不同。相對的做法是在體(in vivo):活果蠅頭部固定、打開腦殼記錄。
本頁用語(每頁可單獨查閱,故重複列出):
- 蘑菇體、KC、葉、區室:蘑菇體(mushroom body)是果蠅腦中把氣味和好壞經驗連起來的構造;代表氣味的 Kenyon 細胞(KC)把軸突成束排成幾條「葉」,每條葉沿長度切成一格一格的「區室」(例如 γ1pedc、γ4、α1),細胞以所在區室命名(見 e-mushroom-body、c-mb-compartment)。
- 常見詞:PAM/PPL1=兩群多巴胺神經元(DAN),分別多傳遞獎賞/懲罰;光遺傳=讓神經元帶上照光就放電的蛋白(e-cschrimson);離體=把腦取出泡在養液裡,活體=活果蠅固定後看腦;順向配對=氣味先、多巴胺後,逆向=多巴胺先;「未配對」=兩種刺激錯開、不同時出現;cAMP=多巴胺受體被活化後在細胞內產生的訊號小分子;※ 推論=本庫推得、原文沒明說,?待查=要靠其他資料確認。
- KC、DAN、MBON:Kenyon 細胞(代表氣味)、多巴胺神經元、蘑菇體輸出神經元(見 e-kenyon-cell、e-dopaminergic-neuron、e-mbon)。
- 乙醯膽鹼:嗅覺訊號傳給 KC 時用的化學物質;在取出的腦上滴它,等於「假裝聞到氣味」。
- 離子導入:用電流把藥從玻璃細針推出。
- P2X2+ATP、CsChrimson:讓選定神經元遇 ATP 或紅光就放電的兩種外加通道(見 e-p2x2、e-cschrimson)。
- ΔF/F0、ΔR/R0:螢光(或兩色比值)相對刺激前的變化比例。
怎麼算 / 怎麼判定
不是一個量,而是一種製備;判定一篇是否「用」它,看它的結論是否在取出的腦上量得。本庫有三類用途:(1) 以乙醯膽鹼模擬氣味、以藥物或 P2X2 模擬多巴胺,量 KC 內訊號或 KC→MBON 突觸;(2) 以光或 ATP 活化一群細胞、看另一群有沒有反應,測功能連結;(3) 當對照,看活體中的某個樣式在離體時是否消失。
庫內的用法
| 來源 | 怎麼用 | 得到什麼 |
|---|---|---|
| s-tomchik-2009-camp-dynamics | 整顆腦灌流(1 ml/min),解剖後 1.5 h 內記錄;30 mM 乙醯膽鹼噴萼部、1 mM 多巴胺噴葉部 | KC 軸突 cAMP 的配對協同與時間窗(見 c-coincidence-detection) |
| s-cohn-2015-coordinated-neuromodulation | 乙醯膽鹼離子導入萼部;P2X2+2 mM ATP 活化 58E02 DAN 或單一 MBON;γ4 MBON 膜片鉗 | 離體時各區室 KC 末梢鈣大致均勻(n=6),作者以此對照活體的分區樣式;離體 DAN 自發活動大幅減少(資料未示);單獨活化 DAN 使 γ4 突觸增強 |
| s-handler-2019-dopamine-receptor-timing | 1–4 日齡腦;10 mM 乙醯膽鹼離子導入 500 ms;P2X2+2 mM ATP,5 × 100 ms | γ4 突觸的時間差曲線(時間差=DAN 活化開始減 KC 刺激開始,負值=多巴胺先到:−1.2 s 增強、0 與 +0.5 s 減弱、±6 s 幾乎不變);cAMP 與內質網鈣 |
| s-felsenberg-2017-re-evaluation | 腦泡充氧緩衝液;CsChrimson 活化 MBON(630 nm,40 Hz × 10 ms),GCaMP 看 DAN | 活化 γ2α′1 MBON 使 MB-MV1 與 γ5 的 PAM 鈣上升(約 0.03 → 0.72,4 筆;約 0.01 → 0.53,5 筆,從圖判讀);活化 V2 MBON 使 PPL1 細胞體一升一降一不顯著 |
| s-felsenberg-2018-memory-extinction | 同上協定;VT1211-LexA 活化 M4β′/M6,R48B04 看 PAM 末梢 | γ5 PAM ΔF/F0 約 +1.75(5 腦,從圖判讀),γ4 無反應,β′2p/β′2m 輕微抑制 |
參數見 numbers。
引用時的陷阱
- 離體腦的狀態與活體不同。 Cohn 2015 指出離體時 DAN 的自發活動大幅減少,正是它用來解釋「分區樣式消失」的理由;所以在離體量到的突觸規則,起點狀態可能與活果蠅不同。
- 刺激是人工的。 乙醯膽鹼的劑量與時長不等於真實氣味;Tomchik 2009 依反應調整噴射壓力與位置,各腦劑量不可比。Cohn 2015 主文沒寫 ATP 噴注的時長與壓力(?待查),與 Handler 2019 的 DAN 刺激強度無法比較,見 syn-contradictions 1.3。
- 「活化 A,B 有反應」不等於直接相連。 Felsenberg 2017、2018 與 Cohn 2015 的連結實驗都沒有區分單突觸與多突觸,也沒有氣味。
- 離體 n 常很小(Felsenberg 2017 為 4、5 筆;Felsenberg 2018 為 5 腦)。
- 同類製備、不同結果要先比參數。 Cohn 2015 與 Handler 2019 同實驗室、同 γ4 MBON、同 P2X2 製備,對「未配對的多巴胺」得到不同圖像(1.3),不在本頁裁決。
相關
- 概念:c-whole-cell-patch-clamp、c-presynaptic-calcium、c-us-substitution、c-kc-mbon-plasticity
- 實體:e-p2x2、e-cschrimson、e-gcamp、e-epac-camp-sensor
- 主題:t-dopamine-to-plasticity、t-mbon-dan-feedback;矛盾:syn-contradictions
- 來源:s-tomchik-2009-camp-dynamics、s-cohn-2015-coordinated-neuromodulation、s-handler-2019-dopamine-receptor-timing、s-felsenberg-2017-re-evaluation、s-felsenberg-2018-memory-extinction
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突觸前末梢的鈣(presynaptic calcium) 全細胞膜片鉗記錄(whole-cell patch clamp) c739-GAL4 驅動品系(c739-GAL4) KC 上的多巴胺受體(dopamine receptors DopR1/DopR2) GCaMP 系鈣感測器(GCaMP calcium indicators) MB099C 驅動品系(MB099C split-GAL4) MB504B 驅動品系(MB504B split-GAL4) MBON-γ1pedc(MVP2) MBON-γ2α′1(γ2α′1 輸出神經元) γ4 輸出神經元(γ4 MBON) MBON-γ5β′2a(M6;γ5 MBON) 蘑菇體(mushroom body) 四象限光遺傳嗅覺競技場(optogenetic olfactory arena) ATP 門控通道 P2X2(化學活化,chemogenetic activation) PAM-α1 多巴胺神經元(PAM-α1) PPL1-γ1pedc 多巴胺神經元(PPL1-γ1pedc, MB-MP1) PPL1-γ2α′1 多巴胺神經元(PPL1-γ2α′1, MB-MV1) R58E02 驅動品系(R58E02 driver lines) 溫度敏感型阻斷工具(shibire^ts1) T 迷宮(T-maze) TH-GAL4 與 TH+DDC 驅動(TH-GAL4 and TH/DDC drivers) 索引 Cohn 2015 · coordinated neuromodulation 從多巴胺到突觸改變:KC 軸突怎麼讀出增強訊號 輸出神經元回頭指揮多巴胺神經元:MBON→DAN 回饋迴路 先後與間隔:氣味和多巴胺的時序如何決定學到什麼
突觸前末梢的鈣(presynaptic calcium) 全細胞膜片鉗記錄(whole-cell patch clamp) c739-GAL4 驅動品系(c739-GAL4) KC 上的多巴胺受體(dopamine receptors DopR1/DopR2) GCaMP 系鈣感測器(GCaMP calcium indicators) MB099C 驅動品系(MB099C split-GAL4) MB504B 驅動品系(MB504B split-GAL4) MBON-γ1pedc(MVP2) MBON-γ2α′1(γ2α′1 輸出神經元) γ4 輸出神經元(γ4 MBON) MBON-γ5β′2a(M6;γ5 MBON) 蘑菇體(mushroom body) 四象限光遺傳嗅覺競技場(optogenetic olfactory arena) ATP 門控通道 P2X2(化學活化,chemogenetic activation) PAM-α1 多巴胺神經元(PAM-α1) PPL1-γ1pedc 多巴胺神經元(PPL1-γ1pedc, MB-MP1) PPL1-γ2α′1 多巴胺神經元(PPL1-γ2α′1, MB-MV1) R58E02 驅動品系(R58E02 driver lines) 溫度敏感型阻斷工具(shibire^ts1) T 迷宮(T-maze) TH-GAL4 與 TH+DDC 驅動(TH-GAL4 and TH/DDC drivers) 索引 Cohn 2015 · coordinated neuromodulation 從多巴胺到突觸改變:KC 軸突怎麼讀出增強訊號 輸出神經元回頭指揮多巴胺神經元:MBON→DAN 回饋迴路 先後與間隔:氣味和多巴胺的時序如何決定學到什麼